Engenharia genética de DNA recombinante

Isolando o clone

Em geral, a clonagem é realizada para obter o clone de um gene ou sequência de DNA particular de interesse. O próximo passo após a clonagem, portanto, é encontrar e isolar esse clone entre outros membros da biblioteca. Se a biblioteca engloba todo o genoma de um organismo, então em algum lugar dessa biblioteca será o clone desejado. Existem várias maneiras de encontrá-lo, dependendo do gene específico em questão. Mais comumente, um segmento de DNA clonado que mostra homologia com o gene procurado é usado como sonda. Por exemplo, se um gene de camundongo já tiver sido clonado, esse clone poderá ser usado para encontrar o clone humano equivalente de uma biblioteca genômica humana. Colônias bacterianas que constituem uma biblioteca são cultivadas em uma coleção de placas de Petri. Em seguida, uma membrana porosa é colocada sobre a superfície de cada placa e as células aderem à membrana. As células são rompidas e o DNA é separado em filamentos únicos - todos na membrana. A sonda também é separada em filamentos simples e rotulada, geralmente com fósforo radioativo. Uma solução da sonda radioativa é então usada para banhar a membrana. O DNA da sonda de fita simples aderirá apenas ao DNA do clone que contém o gene equivalente. A membrana é seca e colocada contra uma folha de filme sensível à radiação e, em algum lugar dos filmes, uma mancha preta aparecerá, anunciando a presença e a localização do clone desejado. O clone pode ser recuperado das placas de Petri originais.

genética: tecnologia de DNA recombinante e reação em cadeia da polimerase

Os avanços técnicos desempenharam um papel importante no avanço da compreensão genética. Em 1970, os microbiologistas americanos Daniel Nathans

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Sequenciamento de DNA

Uma vez clonado um segmento de DNA, sua sequência nucleotídica pode ser determinada. A sequência nucleotídica é o nível mais fundamental de conhecimento de um gene ou genoma. É o plano que contém as instruções para a construção de um organismo, e nenhum entendimento da função ou evolução genética poderia estar completo sem a obtenção dessas informações.

Usos

O conhecimento da sequência de um segmento de DNA tem muitos usos, e alguns exemplos a seguir. Primeiro, ele pode ser usado para encontrar genes, segmentos de DNA que codificam para uma proteína ou fenótipo específico. Se uma região do DNA foi sequenciada, ela pode ser rastreada quanto a características dos genes. Por exemplo, quadros de leitura aberta (ORFs) - sequências longas que começam com um códon inicial (três nucleotídeos adjacentes; a sequência de um códon determina a produção de aminoácidos) e são ininterruptas pelos códons de parada (exceto um em sua terminação) - região codificadora de proteínas. Além disso, os genes humanos são geralmente adjacentes às chamadas ilhas CpG - aglomerados de citosina e guanina, dois dos nucleotídeos que compõem o DNA. Se um gene com um fenótipo conhecido (como um gene de doença em humanos) estiver na região cromossômica sequenciada, os genes não atribuídos na região se tornarão candidatos a essa função. Segundo, sequências de DNA homólogas de diferentes organismos podem ser comparadas para traçar relações evolutivas tanto dentro como entre as espécies. Terceiro, uma sequência genética pode ser rastreada para regiões funcionais. Para determinar a função de um gene, vários domínios podem ser identificados que são comuns a proteínas de função semelhante. Por exemplo, certas seqüências de aminoácidos dentro de um gene são sempre encontradas em proteínas que abrangem uma membrana celular; esses trechos de aminoácidos são chamados domínios transmembranares. Se um domínio transmembranar for encontrado em um gene de função desconhecida, isso sugere que a proteína codificada está localizada na membrana celular. Outros domínios caracterizam proteínas de ligação ao DNA. Vários bancos de dados públicos de seqüências de DNA estão disponíveis para análise por qualquer indivíduo interessado.